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抗体定制平台
- 服务内容
服务编号 服务内容 服务价格 服务周期 AF1004-1 组织切片（单标双色） 45元/张 2天 AF1004-2 组织切片（双标三色） 65元/张 3天 AF1004-3 组织切片（三标四色） 200元/张 4天 AF1004-4 组织切片（四标五色） 300元/张 5天 AF1004-5 组织切片（五标六色） 800元/张 6天 AF1004-6 组织切片（六标七色） 4000元/张 7天 AF1004-7 组织芯片（单标双色） 300元/张 3天 AF1004-8 组织芯片（双标三色） 500元/张 3天 AF1004-9 组织芯片（三标四色） 1500元/张 4天 AF1004-10 组织芯片（四标五色） 2500元/张 5天 AF1004-11 组织芯片（五标六色） 4000元/张 6天 AF1004-12 组织芯片（六标七色） 8000元/张 7天 AF1004-13 组织切片荧光扫描（单标双色） 80元/张 3天 AF1004-14 组织切片荧光扫描（双标三色） 100元/张 3天 AF1004-15 组织切片荧光扫描（三标四色） 150元/张 5天 AF1004-16 组织切片荧光扫描（四标五色） 300元/张 5天 AF1004-17 组织切片荧光扫描（五标六色） 500元/张 5天 AF1004-18 组织切片荧光扫描（六标七色） 1000元/张 5天 AF1004-19 组织芯片荧光扫描（单标双色） 1000元/张 3天 AF1004-20 组织芯片荧光扫描（双标三色） 1500元/张 3天 AF1004-21 组织芯片荧光扫描（三标四色） 2500元/张 5天 AF1004-22 组织芯片荧光扫描（四标五色） 3500元/张 5天 AF1004-23 组织芯片荧光扫描（五标六色） 5000元/张 5天 AF1004-24 组织芯片荧光扫描（六标七色） 8000元/张 5天 - 服务简介
酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-HRP二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
- 交付标准1、多重免疫荧光染色后剩余第一抗体等物料2、多重免疫荧光染色染色完整实验报告一份
- 结果展示
佛山粒子生物科技有限公司
TSA多重免疫荧光实验标准操作流程（石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片）
6.1石蜡组织
工作步骤一：脱蜡
1
实验前检查各染缸内的染料及试剂，开启通风橱内的风机开关
保证各染缸液面能没过切片上的组织
2
65℃烤片2h；
把切片从切片盒里小心的拿出，正面朝上，放入温度已达到65℃的烤片机里烤片2 h；如果组织切片在切片时已经进行如上烤片，则只需烤片10 min左右至石蜡完全溶解。
3
把待处理的石蜡切片依次装入染色架上；
烤片完成后把石蜡切片迅速的从烤片机拿出，依次插入染色架里的卡槽里。
4
二甲苯（Ⅰ）中脱蜡10 min；
从烤片机里拿出来到放入装有二甲苯的染色缸的过程中要迅速，因为在保持一定温度下脱蜡，石蜡更容易被二甲苯溶解。
5
二甲苯（Ⅱ）中脱蜡10 min；
此步主要是进一步脱蜡，使组织中的石蜡完全溶于二甲苯中。
6
100%乙醇（Ⅰ）中5 min；
把芯片从二甲苯染色缸中拿出稍晾干，轻轻放入100%乙醇中，二甲苯跟酒精互溶，洗去二甲苯。
7
100%乙醇（Ⅱ）中5 min；
进一步洗去二甲苯,确保二甲苯清洗干净。
工作步骤二：水化
1
95%乙醇中水化5 min
严格按实验流程操作，目的是使组织细胞充水，恢复脱水前状态。
2
85%乙醇中水化5 min
3
75%乙醇中水化5 min
4
PBS浸洗3次各5 min
5
PBST浸洗30 S
工作步骤三：抗原修复
1
组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。
根据抗原的不同选择合适的抗原修复液
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤四：封闭
1
3%过氧化氢溶液室温封闭15 min
封闭内源性过氧化氢酶，降低其背景染色。
2
PBST浸洗3次各5 min
3
滴加非免疫正常山羊血清100 μl，室温孵育30 min
工作步骤六：孵育抗体
1
甩去封闭液，滴加100 μl即用型一抗，4℃孵育过夜
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型
2
PBST浸洗3次各5 min
3
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min
4
PBST浸洗5次各5 min
工作步骤八：TSA荧光染料标记显色
1
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min
具体时间根据预实验及经验确定！
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤九：重复步骤三至步骤八
1
工作步骤八换用另外一种TYR-XXX荧光染料
根据标记抗原的数量不断重复步骤三至步骤八直至完成所有标记
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤十：DAPI复染细胞核
1
玻片置于PBST（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min
工作步骤十一：荧光封片
1
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
工作步骤十二：镜检
1
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
6.2细胞爬片
工作步骤一：爬片准备
1
将多聚甲醛固定15min的爬片，PBS浸洗3次各5 min
2
0.1% TritonX-100 破膜15min，PBST浸洗3次各5 min
检测核/质表达的蛋白采用此步骤；但检测膜表达的抗体不需要此步骤。
工作步骤二：封闭
1
滴加非免疫正常山羊血清100-200 μl，室温孵育30 min
工作步骤三：孵育抗体
1
甩去封闭液，滴加100-200 μl即用型一抗，4℃孵育过夜
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型
2
PBST浸洗3次各5 min
3
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min
4
PBST浸洗5次各5 min
工作步骤四：TSA荧光染料标记显色
1
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min
具体时间根据预实验及经验确定！
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤五：上一轮抗体洗脱
1
滴加适量37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37℃放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37℃放置5-20分钟，弃洗脱液。
2
PBS浸洗3次各5 min
工作步骤六：重复步骤二至步骤五
1
工作步骤四换用另外一种TYR-XXX荧光染料
根据标记抗原的数量不断重复步骤二至步骤五直至完成所有标记
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤七：DAPI复染细胞核
1
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min
工作步骤八：荧光封片
1
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
工作步骤九：镜检
1
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
6.3冰冻切片
工作步骤一：样本准备
1
将甲醇固定20min的冰冻切片，在纯水浸泡5 min
2
0.1% TritonX-100 破膜15min，PBST浸洗3次各5 min
检测核/质表达的蛋白采用此步骤；但检测膜表达的抗体不需要此步骤。
工作步骤二：封闭
1
3%过氧化氢溶液室温封闭15 min
封闭内源性过氧化氢酶，降低其背景染色。
2
PBST浸洗3次各5 min
3
滴加非免疫正常山羊血清100 μl，室温孵育30 min
工作步骤三：孵育抗体
1
甩去封闭液，滴加100 μl即用型一抗，4℃孵育过夜
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型
2
PBST浸洗3次各5 min
3
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min
4
PBST浸洗5次各5 min
工作步骤四：TSA荧光染料标记显色
1
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min
具体时间根据预实验及经验确定！
2
PBS浸洗3次各5 min
工作步骤五：上一轮抗体洗脱
1
滴加适量37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37℃放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37℃放置5-20分钟，弃洗脱液。
2
PBS浸洗3次各5 min
工作步骤六：重复步骤二至步骤五
1
工作步骤四换用另外一种TYR-XXX荧光染料
根据标记抗原的数量不断重复步骤二至步骤五直至完成所有标记
2
PBST浸洗3次各5 min
工作步骤七：DAPI复染细胞核
1
玻片置于PBST（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min
工作步骤八：荧光封片
1
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
工作步骤九：镜检
1
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。